安徽大学健康研究院

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蛋白表达、纯化与结晶收费定价(试用)


发表日期:2014-10-29 发表人:宾艳南

实验流程

校外

蛋白

表达

一、成功构建基因表达载体(2周)

500

(上下游引物合成费、测序费用另计)

二、蛋白表达

1周)

500

(包涵体收取50%费用,无表达不收费)

三、蛋白纯化

3600

(促溶标签需酶切除的蛋白7200//5~10mg

四、蛋白结晶

1200/每个蛋白

四个初筛条件

总计

5800/9400


具体实验内容(针对于大肠杆菌E. coil表达系统):

一、 蛋白表达之成功构建基因表达载体(2周)

1. 实验步骤

1)      根据目标蛋白的cDNA序列设计引物,上下游引物5’端和3’端引入酶切位点(常用限制性内切酶NdeI、XhoI、BamHI、HindIII、NotI、SalI),合成设计好的上下游引物

2)      利用PCR方法扩增得到基因序列,将该基因进行双酶切和酶切产物回收。

3)      选择表达质粒(常用质粒pET28a、pET22b、pET28a-sumo、pET28a-Pgex-4t-2),根据引物所选择的限制性内切酶对表达质粒进行双酶切处理,并用PCR回收试剂盒对酶切产物进行回收。

4)      利用T4 DNA连接酶将双酶切后的基因片段和质粒进行连接,转化至E.coli Top10菌株,涂平板,挑取阳性单克隆,测序验证构建质粒的准确性。

5)      蛋白表达失败,需更换载体后再构建新质粒,只需付首次构建费用的50%。

2. 交付内容:正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的Top10菌株及测序报告。

3. 备注:根据上下游引物碱基的多少合成费不同(0.5¥/bp,邮费15元);基因片段不同其测序费用不同(18、36、72


二、 蛋白表达之IPTG诱导

1. 实验步骤

1)      扩增并抽提构建好的重组表达质粒。

2)      将表达质粒转化至高效的E.coli表达菌株中,可提供BL21(DE3)和Roseter表达菌株。

3)      挑取阳性克隆于LB培养基中扩增并选择合适的条件(时间、温度及IPTG浓度等表达条件)进行IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况,筛选出合适菌株。

2. 交付内容:重构质粒的表达菌株及表达检测报告。

3.备注:蛋白可溶性表达收取全额费用,包涵体收取50%费用,无表达不收费。


三、     蛋白纯化

1. 实验步骤

1)      摇瓶培养1L重构质粒的表达菌株,通过Ni柱进行初步纯化,再过凝胶过滤层析或离子交换等方法进一步纯化。

2)      利用蛋白酶去除不需要的纯化标签,通过Ni柱进行初步纯化,再过凝胶过滤层析或离子交换等方法进一步纯化。

3)      通过SDS-PAGE电泳检测每一步结果,检测并控制最终所得蛋白的状态和质量。

2. 交付内容:纯化好的目标蛋白~10mg及纯化报告。

3. 备注:纯化标签需酶切除的蛋白纯化工艺复杂费用另计。

4. 详细说明:

1)      如果没有获得目标蛋白,只收取一定的成本费。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品,则双方协商本步骤费用。

2)      如果客户需要详细的纯化工艺,包括详细纯化条件及每步结果,则需要加收100%相应费用。
因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同,我们最终根据实际情况将给客户提供最少5mg,最多10mg的目标蛋白,所收取的费用是相同的。

3)      我们提供的最终产品一般为保存于常规的缓冲液(Tris-HCl,PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液)中蛋白质溶液,并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统,所以我们无法保证最终产品的生物学活性,不过我们承诺将会按照最大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。如果客户一定要求目标蛋白活性,我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格,我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30% ,而如果样品活性合格,我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。

四、 蛋白结晶

四个结晶初筛条件:PEG/Ion Screen、 Crystal Screen 、Index、SaltRx

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